Nei primi anni del XVII secolo, il duca Vincenzo I (1587-1612) commissiona all'architetto cremonese Antonio Maria Viani la trasformazione di un'ala della quattrocentesca e fancelliana Domus Nova - scelta quale propria residenza - con accesso dall'atrio degli Arcieri. Il loggione sul Cortile d'Onore, adibito a ricovero dell’inestimabile collezione ducale di pitture, è presto "serrato" e trasformato in Galleria (dal tardo Settecento, detta “Galleria degli Specchi”. A Viani, il quarto duca di Mantova commissiona inoltre la Galleria delle Metamorfosi, dove trovano posto le collezioni delle meraviglie naturali e artificiali. Le stanze, dedicate ai quattro elementi, si affacciano sul giardino già del Padiglione, detto poi dei Semplici, progettato dal frate botanico Zenobio Bocchi per lo stesso Vincenzo I nel 1603.
Nella Domus Nova, Ferdinando Gonzaga (1613-1626) fa realizzare l'appartamento del Paradiso -attualmente sede della Direzione del Museo - e la Scala Santa (1615), riproduzione in miniatura di quella conservata a San Giovanni in Laterano a Roma, ambiente celebrato da Giovanni Rodari quale Appartamento dei Nani di corte: un falso storico, reso credibile per lungo tempo dalle proporzioni degli ambienti. Nel 1627-1628, per fronteggiare le difficoltà economiche del ducato, i pezzi più pregiati delle collezioni Gonzaga - a lungo invidiate da tutte le corti d’Europa - sono venduti da Vincenzo II al re d'Inghilterra Carlo I Stuart. Nel 1630, quanto resta delle mirabili opere d'arte e dei manufatti artistici conservati a Palazzo Ducale viene saccheggiato dai Lanzichenecchi, inviati dall'imperatore Ferdinando II per punire Carlo I Gonzaga Nevers, reo di una politica filofrancese.